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Sistema CRISPR-Cas9

O sistema CRISPR (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeat) associado a proteínas (Cas protein) revolucionou o campo da edição gênica pois é simples e de grande precisão, permitindo modificações genéticas direcionadas.

A tecnologia é basicamente constituída de um RNA guia ou RNAg (sequência de aproximadamente 20 pb de RNA sintético do gene de interesse) que direciona uma nuclease Cas9 para uma região específica onde ocorrerá a clivagem da dupla fita do DNA. A quebra na dupla fita do DNA (DSB/double strand break) ativa o mecanismo de reparo via recombinação homóloga (HR) que insere uma sequência de nucleotídeo flanqueada com regiões de homologia no local, resultando em nocaute ou inserção específica de genes. Para gerar um rompimento direcionado na dupla fita de DNA e ativar o sistema de reparo, a nuclease Cas 9 deve estar presente e estável no núcleo da célula. O procedimento mais simples de manipulação em laboratório é por meio de um vetor de expressão, onde a sequência do gene da Cas9 é clonado sob o controle de promotores e terminadores específicos da transcrição, assim como o gene que codifica para o RNAg.


Essa metodologia tem um grande potencial como ferramenta para modificações do genoma em leveduras devido à especificidade com a qual a nuclease Cas9 reconhece a sequência alvo, à simplicidade da construção do RNA guia e ao fato das modificações serem livres de marcas, como por exemplo marcadores de resistência a antibióticos.

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